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자연 미생물학 7권, 2128~2150페이지(2022)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

시퀀싱의 발전에도 불구하고 표준화가 부족하면 연구 간 비교가 어려워지고 행성 규모의 여러 서식지에 걸쳐 미생물 군집의 구조와 기능에 대한 통찰력이 방해됩니다. 여기에서는 지구 마이크로바이옴 프로젝트를 위해 수집된 다양한 880개의 미생물 군집 샘플에 대한 다중 오믹스 분석을 제시합니다. 우리는 앰플리콘(16S, 18S, ITS) 및 샷건 메타게놈 서열 데이터와 비표적 대사체학 데이터(액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 및 가스 크로마토그래피 질량 분석법)를 포함합니다. 우리는 표준화된 프로토콜과 분석 방법을 사용하여 미생물 군집을 특성화하고 환경 전반에 걸쳐 미생물 관련 대사 산물과 미생물 분류군의 관계와 동시 발생에 중점을 두어 특별한 규모로 다양성을 탐색할 수 있었습니다. 메타게놈 및 대사체 데이터에 대한 참조 데이터베이스 외에도 추가 연구를 통합하기 위한 프레임워크를 제공하여 진화하는 커뮤니티 리소스의 형태로 기존 지식을 확장할 수 있습니다. 우리는 모든 미생물과 대사산물이 환경이 선택하지 않는 모든 곳에 있다는 가설을 테스트하여 이 데이터베이스의 유용성을 입증합니다. 우리의 결과는 대사 산물 다양성이 미생물 군집 및 환경과 관련된 회전율 및 중첩성을 나타내는 반면, 미생물 관련 대사 산물의 상대적 풍부함은 서식지 별 방식으로 특정 미생물 집단과 다양하고 동시에 발생한다는 것을 보여줍니다. 우리는 또한 지구 환경(예: 육상 식물 표면 및 토양, 담수 및 해양 동물 대변)을 구별하는 데 있어 특정 화학, 특히 테르페노이드의 힘은 물론 Conexibacter woesei(육상 토양), Haloquadratum을 포함한 특정 미생물의 힘을 보여줍니다. walsbyi(해양 퇴적물) 및 Pantoea dispersa(육상 식물 찌꺼기). 이 리소스는 지구 전역의 다양한 서식지의 미생물 군집 내 분류군과 대사산물에 대한 통찰력을 제공하여 미생물 및 화학적 생태학에 대한 정보를 제공하고 호스트와 환경에 대한 다중 오믹스 미생물군집 연구를 위한 기초와 방법을 제공합니다.

미생물 생태학의 주요 목표는 미생물 군집의 구조를 이해하고, 이것이 미생물 분류학, 계통발생 및 기능적 구성과 어떻게 관련되는지, 이러한 관계가 공간과 시간에 따라 어떻게 달라지는지 이해하는 것입니다. 단일 연구에서는 그러한 추론을 허용하기 위해 모든 환경을 반복적으로 샘플링할 수 없으므로 서로 다른 연구에 걸쳐 메타 분석을 허용하는 표준화된 방법의 사용을 육성하는 것이 가장 중요합니다1,2,3,4. 박테리아/고세균 공동체의 16S 리보솜 RNA(rRNA) 시퀀싱을 위한 표준화된 프로토콜에 초점을 맞춘 초기 노력은 환경에서 공동체가 어떻게 구조화되는지에 대한 통찰력을 제공하여 숙주 결합 및 염도의 기울기에 따라 미생물 분리의 강력한 축을 지원했습니다1,5. 샷건 메타게놈학 데이터6,7,8,9에 초점을 맞춘 최근의 노력은 환경 전반의 기능적 잠재력에 대한 추가적인 통찰력을 제공하기 시작했으며10,11,12,13,14 현재의 최첨단 방법은 다중 오믹스 접근 방식을 사용합니다. 메타유전체학, 전사체학, 단백질체학 및/또는 대사체학15,16,17,18,19,20,21,22,23,24을 포함합니다.

미생물은 의사소통에서 방어까지 중요한 기능을 수행하는 다양한 2차 대사산물을 생산하며25,26,27 인간의 건강과 환경의 지속가능성에 도움이 될 수 있습니다28,29,30,31,32,33,34. 메타지놈 마이닝 및 전사체학은 미생물 군집의 기능을 특성화하는 강력한 방법인 반면10,14,24 기능적 다양성을 이해하는 보다 강력한 접근 방식은 대사산물의 존재를 확인하고19,20,21 지구 전체의 분포를 정확하게 설명하는 화학적 증거를 생성하는 것입니다. 여기에서 우리는 대사산물의 존재와 상대적인 풍부함을 직접 평가하고 지구 환경 전반에 걸쳐 미생물 군집의 대사산물 프로필에 대한 정확한 설명을 제공하는 접근 방식을 제시합니다. 여러 연구에서 이전에 탠덤 메타유전체학 및 대사체학22,23,35,36,37,38,39,40을 사용했지만 많은 연구에서 상대적으로 제한된 기술적 방법을 사용하거나 상대적으로 적은 수의 대사산물 클래스를 프로파일링하여23,35,40 연구 간 비교가 불가능했습니다. 그것은 우리의 이해를 넓힐 수 있습니다. 또한, 이전의 여러 연구는 범위가 단일 환경이나 서식지20,23,24,35,36,37,38,39로 제한되었습니다. 우리의 작업은 여러 생태계를 포함함으로써 메타유전체학 및 대사체학을 사용하는 미생물 군집의 다중 오믹스 분석과 관련하여 이전에 보고된 것보다 훨씬 더 뛰어납니다. 우리가 적용하는 접근법은 비표적 대사체학을 사용하여 2차 대사산물을 직접 조사하여 메타게놈학을 보완합니다.

1.5–2 kb DNA fragments’ (Oxford Nanopore Technologies). The resulting product consists of uniquely tagged rRNA operon amplicons. The uniquely tagged rRNA operons were amplified in a second PCR, where the reaction (100 µl) contained 2 U Platinum SuperFi DNA Polymerase High Fidelity (Thermo Fisher) and a final concentration of 1X SuperFi buffer, 0.2 mM of each dNTP, and 500 nM of each forward and reverse synthetic primer targeting the tailed primers from above. The PCR cycling parameters consisted of an initial denaturation (3 min at 95 °C) and then 25–35 cycles of denaturation (15 s at 95 °C), annealing (30 s at 60 °C) and extension (6 min at 72 °C), followed by final extension (5 min at 72 °C). The PCR product was purified using the custom bead purification protocol above. Batches of 25 amplicon libraries were barcoded and sent for PacBio Sequel II library preparation and sequencing (Sequel II SMRT Cell 8M and 30 h collection time) at the DNA Sequencing Center at Brigham Young University. Circular consensus sequencing (CCS) reads were generated using CCS v.3.4.1 (https://github.com/PacificBiosciences/ccs) using default settings. UMI consensus sequences were generated using the longread_umi pipeline (https://github.com/SorenKarst/longread_umi) with the following command: longread_umi pacbio_pipeline -d ccs_reads.fq -o out_dir -m 3500 -M 6000 -s 60 -e 60 -f CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -F AGRGTTYGATYMTGGCTCAG -r AATGATACGGCGACCACCGAGATC -R CGACATCGAGGTGCCAAAC -U ‘0.75;1.5;2;0’ -c 2./p>{sample_identifier}_{sequence_identifier}’), concatenated into a single fasta file and imported. We then used QIIME 2’s ‘vsearch’ plugin132 to dereplicate sequences and then cluster them at 65% similarity (that is, due to rapid evolution at bacterial ITS regions). The 65% OTU feature-table had 365 samples and 285 features. The concatenated fasta file and 65% OTU feature-table were uploaded to Qiita as distinct preparations (study: 13114). We then used QIIME 2’s90 ‘feature-table’ plugin to exclude singleton OTUs and samples with a total frequency of <500 reads, and the ‘deicode’91 plugin to estimate beta-diversity for each dataset using robust Aitchison distances91. The final feature-table for full-length rRNA operon beta-diversity analysis included 242 samples and 196 features./p>90)./p>